Como biólogos Ler um Gene com sequenciamento de DNA
A sequenciação de ADN, que determina a ordem dos nucleótidos de uma cadeia de DNA, permite aos cientistas para ler o código genético para que eles possam estudar os genes de versões normais. Ele também lhes permite fazer comparações entre as versões normais de um gene e versões causadores de doenças de um gene.
Depois eles sabem a ordem dos nucleotídeos em ambas as versões de um gene, eles podem identificar quais mudanças no gene causa a doença.
sequenciamento de DNA depende de um tipo especial de nucleótidos, chamado ddNTP (abreviação de trifosfato dideoxyribonucleotide). ddNTPs são um pouco semelhantes aos nucleotídeos do DNA regulares, mas eles são diferentes o suficiente para que eles param de replicação do DNA.
Quando um ddNTP é adicionado a uma cadeia crescente de ADN, polimerase de ADN não é possível adicionar mais nucleótidos de modo que a cadeia em crescimento pára nesse ponto. sequenciamento de DNA usa esta interrupção da cadeia para determinar a ordem dos nucleotídeos em uma fita de DNA.
A maioria sequenciamento de DNA feito hoje é sequenciação de ciclo (Mostrado na figura), um processo que funciona como PCR, para criar muitas cópias do gene a ser sequenciado. Mas, ao contrário do PCR, ddNTPs, bem como nucleótidos regulares são adicionados à mistura. Assim, tal como a polimerase de ADN de distância funciona fazendo muitas cópias do gene, a cada momento e, em seguida, ele agarra um ddNTP (mostrado como rectângulos brancos) em vez de um nucleótido normal (mostrado como rectângulos pretos).
Depois de um ddNTP é adicionado a uma molécula de ADN em crescimento, a replicação é parado. O resultado final do ciclo de sequenciação é muitas cópias parciais do gene a ser sequenciadas, todos os quais estão interrompidos em pontos diferentes e que se encontram, por conseguinte, diferentes comprimentos.
Após as cópias parciais são feitas, os cientistas carregá-los em uma máquina que usa eletroforese em gel para colocar as cópias em ordem por tamanho. Como as sequências parciais passar através da máquina, um laser lê uma etiqueta fluorescente em cada ddNTP, que revela a ordem dos nucleótidos no gene.
Teste a sua compreensão de leitura ddNTP com estas questões práticas:
Um cientista quer para determinar a sequência de um gene associado a uma doença genética. Ela leva amostras de DNA de uma pessoa que tem a versão que causa a doença do gene-las em quatro tubos separados de teste, cada uma contendo nucleótidos, ADN-polimerase, e iniciadores.
Em seguida, em cada tubo, ela adiciona um tipo de didesoxinucleótido - ddATP, ddGTP, ddCTP, ou ddTTP - de forma que cada tubo irá produzir fragmentos de ADN que terminam com um nucleótido particular, (A, G, C, ou T). Depois de executar as reacções de sequenciação, ela carrega os resultados de cada tubo para um gel e separa os fragmentos utilizando electroforese em gel.
Com base nos resultados em sua gel, mostrado nesta figura, o que representa a sequência do gene?
Uma jovem cuja mãe morreu de início precoce de Alzheimer quer saber se ela está em risco de desenvolver a doença. A doença é causada por um alelo dominante, por isso, se a mulher tem apenas uma única cópia do alelo causador da doença, ela vai desenvolver a doença.
Descrever como um cientista poderia usar uma amostra de sangue do jovem para a tela dela para a presença do alelo causadores de doenças. Certifique-se de incluir todas as técnicas necessárias, começando com a amostra de sangue.
A seguir estão as respostas para as questões práticas.
ADN desloca em direcção ao eléctrodo positivo em um gel, e os fragmentos mais pequenos mover a maior distância, de modo que as bandas no gel que são o mais próximo de + são as menores bandas.
O fragmento mais curto (o menor banda) está na faixa que foi carregado com ddCTPs, de modo que o primeiro nucleótido na cadeia de ADN deve ser C. A próxima banda é na faixa que foi carregado com ddTTPs, de modo que o lado de nucleótidos devem ser t .
A próxima banda está novamente na pista C, então o próximo nucleotídeo deve ser um C. Se você continuar lendo o gel do lado do + para o lado - - em outras palavras, a partir da base para o topo - você pode descobrir a resto da sequência de ADN. A sequência inteira é CTC AGC CAT AGG.
O cientista iria extrair DNA a partir da amostra de sangue e, em seguida, usar quer sequenciação de ADN ou as enzimas de restrição para determinar se o jovem transporta o alelo causador da doença.
DNA método de sequenciação: O cientista lê as sequências dos alelos da jovem e compara-os com as sequências conhecidas dos alelos normais e patológicos. O cientista separa amostra de DNA da jovem e coloca-lo em quatro tubos. Cada tubo contém iniciadores para o gene de Alzheimer e lotes de nucleótidos.
Um de cada tubo contenha um ddNTP marcado por fluorescência diferente: uma com ddATP, ddCTP com um, uma com ddGTP, e uma com ddTTP. O cientista coloca os tubos em um sequenciador ciclo, onde passam por muitas rodadas de replicação do DNA.
Em seguida, o cientista executa as amostras através de um gel que os separa por tamanho. O computador detecta o sinal fluorescente no final de cada parte de ADN do menor para o maior e usa-o para reconstruir as sequências de ADN para os alelos da jovem.
Restrição método enzimático: O cientista usa PCR no ADN do sangue para fazer muitas cópias do gene associado com a doença de Alzheimer. Em seguida, o cientista utiliza uma enzima de restrição que é conhecido para cortar de forma diferente dentro das formas normais e de doença do gene.
O cientista corta amostra de DNA da jovem com a enzima de restrição e, em seguida, separa o DNA por eletroforese em gel. O cientista compara os tamanhos dos fragmentos de ADN produzidos por ADN da jovem para o padrão conhecido gerado pelos alelos normais e alelos da doença.